Проект РНФ «Анализ долговременной В-клеточной иммунологической памяти после перенесенной инфекции SARS-CoV-2»

Руководитель: А.Г. Прилипов

Для прогнозирования дальнейшего распространения COVID-19 необходимы знания о продолжительности иммунологической памяти к коронавирусным антигенам. Эффективность разрабатываемых вакцин также будет определяться устойчивостью иммунологической памяти против SARS-CoV-2. Приобретенный иммунитет складывается из трех компонентов: гуморальная, а также Т- и В-клеточная память. Все три компонента участвуют в создании и поддержании иммунологической защиты против SARS-CoV-2. Опубликованные данные, в основном касаются гуморальной иммунологической памяти на SARS-CoV-2. Они свидетельствуют о том, что память на уровне антител сохраняется по крайней мере в течении нескольких месяцев. Показано также, что Т-клеточный ответ на SARS-CoV-2 является вполне продуктивным. Наименее изученным остается вопрос об формировании и продолжительности В-клеточной памяти после перенесенной коронавирусной инфекции. В ряде публикаций были описаны В-клетки памяти, которые образуются вскоре после перенесенного COVID-19, однако в этих работах В-клетки памяти использовались исключительно как источник генов Ig для последующего получения терапевтических моноклональных антител. Вопросы формирования, а также продолжительности В-клеточной памяти в этих работах не рассматривались.

Недавно нами было проведено исследование  В-клеточного иммунитета в острой фазе SARS-CoV-2 инфекции. В исследование было включено более 100 пациентов с COVID-19. Нами было обнаружено, что В-клетки памяти активно образуются во время острой фазы SARS-CoV-2 инфекции. Было также показано, что В-клетки памяти при стимуляции способны дифференцироваться в антитело-секретирующие клетки, которые продуцируют вирус-связывающие и вирус-нейтрализующие антитела. Насколько нам известно, это первое исследование, в котором выполнено количественное определение SARS-CoV-2 специфических антитело-секретирующих клеток методом ELISpot. Полученные нами данные являются хорошей отправной точкой для изучения долговременной В-клеточной памяти после перенесенной коронавирусной инфекции.

В проекте на протяжении 3 лет будет изучена динамика В-клеток памяти у пациентов, переболевших COVID-19. В первую очередь в исследование будут включены бывшие пациенты, для которых В-клетки памяти уже были определены во время острой фазы COVID-19. Тестирование В-клеток памяти будет осуществляться с помощью разработанного нами метода ELISpot с использованием в качестве антигена рекомбинантного поверхностного Spike белка из вируса SARS-CoV-2. Поскольку В-клетки памяти являются покоящимися лимфоцитами, то для стимуляции продукции антител мы будем активировать В-клетки in vitro в течении 7 дней с помощью агониста толл-подобного рецептора 9 или комбинацией IL-21/CD40L. Параллельно этому мы будем также определять вирус-связывающую и вирус-нейтрализующую активность сывороточных антител. Тестирование вирус-нейтрализующей активности будет проводится с помощью биобезопасной системы на основе лентивируса, псевдотипированного белком S из SARS-CoV-2. Динамику вирус-специфических В-клеток памяти мы сравним с кинетикой гуморальной иммунологической памяти. Антиген-специфические В-клетки памяти мы будем окрашивать коронавирусным Spike белком, коньюгированным с фикоэритрином. Антиген-специфические лимфоциты будут отсортированы и гены Ig будут секвенированы из одиночных клеток. Это позволит нам определить динамику репертуара В-клеточного рецептора. Проект будет осуществляться при тесной кооперации с клиникой ФНКЦ ФМБА, которая сейчас полностью перепрофилирована в инфекционный центр для лечения COVID-19. Полученные данные о В-клеточной иммунологической памяти помогут в построении эпидемиологической модели короновирусной инфекции, а также для ответа на вопрос о возможности реинфекции коронавирусом.

Результаты проекта будут также важны для оценки эффективности разрабатываемых вакцин против SARS-CoV-2.

Проект РНФ «Пути фосфорилирования CD45 ассоциированного протеина (CD45-AP) и его роль в процессах активации лимфоцитов человека».

Руководитель: А.В. Филатов

    Фосфатаза CD45 контролирует в лимфоцитах уровень фосфорилирования ряда рецепторов и сигнальных молекул и таким образом является важным регулятором процесса активации лимфоцитов. Однако что управляет активностью самого CD45 остается невыясненным до настоящего времени. На роль регулятора может претендовать так называемый «CD45 ассоциированный протеин» (CD45-AP). Этот белок образует надмолекулярный комплекс не только с CD45, но также взаимодействует с корецептором CD4 и киназой Lck. Имеются веские основания полагать, что белок CD45-AP выполняет в клетке какие-то важные, но пока неизвестные функции. Прежде всего, сама ассоциация CD45-AP с CD45, CD4 и Lck очевидно не является случайной, а отражает тесные взаимодействия между этими молекулами. Во-вторых, известно, что белок CD45-AP может фосфорилироваться, а это является указанием на его возможную регуляторную роль белка CD45-AP. В третьих, степень его фосфорилирования зависит от активации клетки. Целью проекта является выяснение функции молекулы CD45-AP.

Протеин CD45-AP не принадлежит ни к одному известному семейству белков и не имеет гомологов. Доменная организация этого белка неизвестна, а функция не определена, поэтому в данном исследовании придется решать абсолютно новые научные задачи.

 

Проект РНФ «Поиск новых факторов рестрикции ВИЧ-1, ограничивающих репликацию вируса в условиях его межклеточной трансмиссии, путем скрининга библиотеки нокаутов GeCKO».

Руководитель: Д.В. Мазуров

    Изучение факторов рестрикции ВИЧ важно для понимания эволюции врожденной невосприимчивости к ретровирусам. Известно, что ВИЧ не размножается ни в мышах, ни в обезьянах, что обеспечивается множеством факторов естественной невосприимчивости клеток к вирусу. У человека также включаются механизмы клеточной резистентности к ВИЧ, однако вирус с помощью своих вспомогательных белков эффективно выключает данные механизмы. Тот факт, что ВИЧ на начальных стадиях заражения человека размножается в лимфоузлах, где формируется множество контактов между иммунными клетками, указывает на то, что межклеточная трансмиссия вируса играет первостепенную роль в заражении Т-клеток. В рамках проекта планируется провести поиск и обнаружить новые факторы рестрикции, противодействующие размножению ВИЧ в данных условиях, а также вскрыть механизм их действия на вирус. Это позволит глубже понять патогенез СПИДа на ранних стадиях заражения и выработать новую стратегию усиления естественной резистентности к ВИЧ.

 

Проект РФФИ «Создание аденовирусного вектора на основе нуклеазы Cas9, гидовой РНК и донорской ДНК для эффективного редактирования генома человека».

Руководитель: Д.В. Мазуров

   Целью проекта является поиск путей повышения эффективности гомологичной рекомбинации (HR), индуцированной двухспиральным разрывом ДНК. Планируется проверить гипотезу усиления рекомбинации в результате целенаправленной доставки донорской ДНК к месту репарации геномной ДНК. Для этого гидовая РНК будет модифицирована путем присоединения с 5’- или 3’-конца короткой области гомологии с донорской ДНК. Это вероятно будет способствовать образованию комплекса, состоящего из донорской ДНК, гидовой РНК и нуклеазы Cas9 и усилению гомологичной рекомбинации (HR). Кроме того, будет определена оптимальная длина донорсокой ДНК, соответствующая наиболее высокому уровню рекомбинации. Уровень HR будет оцениваться по степени репарации мутированного гена-репортера gfp-turbo, клеточная модель которого будет также создана. Так как наиболее эффективным и безопасным способом доставки генов в первичные клетки человека считаются аденовирусные векторы, то на следующем этапе экспрессионные кассеты с нуклеазой Cas9, модифицированной гидовой РНК и донорской ДНК будут собраны в промежуточном векторе и затем клонированы в конечный вектор Ad5. Полученные с помощью вектора аденовирусные частицы будут тестированы сначала в модельном эксперименте на клеточных линиях с дефектным геном-репортером, а в конечном итоге на стволовых клетках крови пуповины. В случае успешного тестирования метода in vitro его можно будет испытать в клинической практике для эффективной коррекции моногенных заболеваний человека таких например, как гемофилия, тяжелый комбинированный Х-сцепленный иммунодефицит человека и пр.