COVID19

Каково качество и продолжительность вирус-специфической В-клеточной памяти после перенесённой инфекции SARS-CoV-2?

В декабре 2019 в Китае были зарегистрированы первые случаи заболевания COVID-19. Уже 11 марта 2020 года распространение вируса достигло общемировых масштабов и было признано пандемией.
Известно, что успех в борьбе с данной вирусной инфекцией будет определяться профилактическими мерами, в частности, разработкой вакцины против SARS-CoV-2. Однако эффективность этой вакцины будет зависеть от качества иммунологической памяти к коронавирусным антигенам. На данный момент отсутствует какая-либо информация об иммунологической памяти на SARS-CoV-2, опосредованной В-клетками. 
В мае 2020 года наша лаборатория запустила проект по анализу долговременной В-клеточной иммунологической памяти после перенесённой инфекции SARS-CoV-2. Сейчас мы изучаем формирование В-клеток памяти в острый период заболевания. В дальнейшем мы изучим динамику В-клеток памяти у COVID-19 переболевших пациентов в течение 2 лет после перенесённой инфекции. Полученные нами результаты будут иметь важное значение в прогнозировании дальнейшего распространения SARS-CoV-2.

Известно, что ранний В-клеточный ответ обусловлен, по большей части, короткоживущими антителосекретирующими клетками – плазмабластами. Одновременно, другие В-клеточные популяции проходят селекцию в зародышевых центрах вторичных лимфоидных органов, превращаясь в высокоаффинные долгоживущие антителосекретирующие плазматические клетки, которые мигрируют в костный мозг, либо остаются в циркуляции в виде В-клеток памяти.
Предыдущие исследования раненого и долговременного В-клеточного иммунитета после перенесенной коронавирусной инфекции (COVID-19), показали, что количество спайк-специфических IgG+ В-клеток памяти сохраняется или даже растет в течение 6-12 месяцев после заболевания. Анализ моноклональных антител, полученных от этих В-клеток памяти, указывает на то, что в течение данного времени В-клетки памяти продолжают эволюционировать (что подтверждается высоким уровнем соматических гипермутаций), улучшая аффинность и нейтрализующую способность секретируемых антител.
В последние годы были открыты несколько новых подтипов активированных В-клеток и В-клеток памяти [1]. Так, были идентифицированы двойные негативные В-клетки (DN), или атипичные В-клетки памяти, которые не экспрессируют на своей поверхности иммуноглобулин D и маркер CD27. Размер данной популяции увеличивается с возрастом, а также составляет значимую часть В-клеточного звена у пациентов с хроническими инфекциями и аутоиммунными заболеваниями. В зависимости от экспрессии хемокинового рецептора CXCR5 DN В-клетки разделяют на 2 субпопуляции: DN1 (CXCR5+) и DN2 (CXCR5-). Кроме того, подтип DN1 В-клеток характеризуется отсутствием маркеров CD11c и FсRL5. По транскрипционному профилю данная субпопуляция близка к В-клеткам памяти с «переключенным» фенотипом (прошедшим переключение секреции изотипов иммуноглобулинов на IgG и/или IgA).
Для DN2-субпопуляции (CXCR5-/CD21-) характерна экспрессия CD11c и FсRL5, а также фактора транскрипции T-bet. Считается, что данная субпопуляция берет начало от активированных наивных В-клеток и развивается по вне-фолликулярному пути. Некоторые исследователи выделяют дополнительную субпопуляцию DN3 В-клеток молекулярным фенотипом: CD11c-/FcRL5- и CXCR5-/CD21-. DN3 В-клетки развиваются вне зародышевых центров и, скорее всего, представляют собой предшественников DN2-субпопуляции.
Показано, что DN2-субпопуляция более широко представлена у лиц, страдающих аутоиммунными заболеваниями, и возможно, вносят вклад в секрецию ауто-антител. Кроме того, данная субпопуляция обнаруживается в большем количестве у пациентов с тяжелым течением COVID-19, когда в ходе иммунного ответа наблюдается недостаточно активное образование новых зародышевых центров. Однако показано, что после выздоровления различие в соотношениях DN-субпопуляций у больных тяжелой и не тяжелой формами COVID-19 пропадало.
В работе [2] Raphael A. Reyes с коллегами проводили оценку влияния тяжести протекания COVID-19 на состав формирующегося компартмента В-клеточной памяти. Оценку В-клеточного звена проводили в течение 5 месяцев после перенесенного заболевания. Используя мультипараметрическую спектральную проточную цитометрию, авторы исследовали фенотип В-клеток памяти, специфичных к S-белку SARS-CoV-2 или к RBD-домену S-белка. 16 пациентов, принявших участие в исследовании, были разделены на 2 группы: в первую группу вошли лица с тяжелым течением COVID-19 (те, которым требовалась инвазивная механическая вентиляция легких или экстракорпоральная мембранная оксигенация), остальные пациенты составили группу нетяжелого течения заболевания.
Через месяц после выздоровления в крови пациентов обеих групп были обнаружены спайк-специфические IgG+ В-клетки, состоящие преимущественно из В-клеток памяти, а также небольшая фракция DN1 В-клеток. Независимо от тяжести заболевания в обеих группах спайк-специфические IgG+ В-клетки отличались более высокой экспрессией активационных маркеров: CD80, Ki-67 и CD95. Однако, в группе пациентов с нетяжелым течением COVID-19 спайк-специфические IgG+ В-клетки отличались более высоким уровнем экспрессии T-bet (28% против 10%). Известно, что клетки, экспрессирующие транскрипционный фактор T-bet, имеют особый молекулярный фенотип, включая присутствие на поверхности CD11c и FсRL5 и отсутствие CD21. В данном исследовании также было показано, что процент FсRL5+ спайк-специфических IgG+ В-клеток был выше в группе пациентов с нетяжелым течением заболевания. Экспрессия CD11c и CD21 на спайк-специфических IgG+ В-клетках статистически не различалась между двумя исследуемыми группами. При сравнении экспрессии CD11c, CD21и FсRL5 на всех IgG+ В-клетках между двумя группами было выявлено лишь небольшое увеличение FсRL5+ В-клеток в группе нетяжелого течения COVID-19. Важно, что повышение экспрессии FсRL5 было более выражено именно в субпопуляции спайк-специфических IgG+ В-клеток, а не во всей популяции IgG+ В-клеток.
Совокупный анализ экспрессии FcRL5, CD11c, CD21, CD27, CXCR3, и CXCR5 на спайк-специфических T-bet+ IgG+ В-клетках позволил ученым выделить 4 субпопуляции клеток, среди которых наиболее многочисленной вне зависимости от степени тяжести заболевания оказалась субпопуляция с молекулярным фенотипом: FcRL5+ CD11c+ CD27+ CXCR3+ CD21- CXCR5-. Такой фенотип В-клеток ранее был обнаружен у лиц после вакцинации от вируса гриппа. Присутствие данной субпопуляции, как правило, ассоциируют с развитием длительного гуморального иммунитета. В целом можно сказать, что преобладание в второй группе спайк-специфических IgG+ В-клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток, обеспечивающих долговременный иммунитет, говорит о том, что тяжесть заболевания оказывает влияние на качество В-клеточного иммунного ответа.
В более ранних исследования, посвященных оценке динамики В-клеточного иммунитета после COVID-19 было показано, что В-клетки памяти продолжают созревать на протяжении года после перенесенной инфекции [3]. В начале течения, как правило, в крови больных содержится большой процент В-клеток, не обладающих специфичностью к RBD-домену. По всей видимости, такие клетки берут начало от предсуществующих В-клеток памяти, обладающих кросс-реактивностью с другими коронавирусами. В эксперименте Raphael A. Reyes усиление аффинности секретируемых спайк-специфическими В-клетками антител к RBD-последовательности и их нейтрализующей способности происходило в интервале от 2-3 до 4-5 недель после возникновения первых симптомов и не претерпевало изменений при анализе В-клеток памяти спустя 5 месяцев.
Кроме того, различия в пропорции спайк-специфических В-клеток памяти между двумя группами пациентов также нивелировалось. Экспрессия T-bet была максимальной через 2-3 недели после начала заболевания, а затем падала до исходного уровня независимо от исследуемой группы пациентов. Большинство спайк-специфических В-клеток памяти имели фенотип покоящихся клеток (снижалась экспрессия CD80, Ki-67 и CD95) и их количество падало до исходного уровня. И только число спайк-специфических В-клеток с переключенным фенотипом (IgG+) находилось несколько выше базовой линии спустя 20-23 недели после начала проявления симптомов. В целом можно сказать, что значимое увеличение спайк-специфических T-bet+ В-клеток в периферической крови может быть маркером недавнего контакте индивидуума с вирусным антигеном.

  1. Sachinidis A, Garyfallos A. Double Negative (DN) B cells: A connecting bridge between rheumatic diseases and COVID-19?. Mediterr J Rheumatol. 2021;32(3):192-199. Published 2021 Sep 30. doi:10.31138/mjr.32.3.192
  2. Reyes RA, Clarke K, Gonzales SJ, Cantwell AM, Garza R, Catano G, Tragus RE, Patterson TF, Bol S, Bunnik EM. SARS-CoV-2 spike-specific memory B cells express higher levels of T-bet and FcRL5 after non-severe COVID-19 as compared to severe disease. PLoS One. 2021 Dec 22;16(12):e0261656. doi: 10.1371/journal.pone.0261656. PMID: 34936684; PMCID: PMC8694470.
  3. Sokal A, Chappert P, Barba-Spaeth G, Roeser A, Fourati S, Azzaoui I, et al. Maturation and persistence of the anti-SARS-CoV-2 memory B cell response. Cell. 2021; 184(5):1201–13. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.01.050 PMID: 33571429

Несмотря на множество общих характеристик, иммунитет, сформированный в результате перенесенной SARS-CoV-2-инфекции, отличается от такового после вакцинации, в первую очередь, тем, что он не ограничивается специфичностью к S-белку коронавируса. В практическом смысле данные различия могут отражаться в выраженности иммунного ответа организма в случае повторного столкновения с патогеном (ре-инфекции).

Первые различия между вакцино-индуцированным и естественно-сформированным иммунитетом появляются еще на уровне формирования плазмобластов. Острая фаза COVID-19 характеризуется массивной экспансией плазмобластов, тогда как вакцинация ведет к их более слабой продукции. Однако в дальнейшем вакцинация приводит к формированию уровня антител, достаточному для обеспечения надежной и долговременной защиты.

Тем не менее, функциональные характеристики антител после перенесенной инфекции и вакцинации остаются различными. Большинство исследований показывает, что как правило, большей специфичностью по отношению к S-белку (в частности, к RBD-последовательности) обладают антитела, сформированные в результате вакцинации, тогда как вирус-нейтрализующая активность выше у антител, образовавшихся после перенесенной инфекции.

Состав вакцины также оказывает влияние на профиль иммунной защиты организма. Более того, на качество иммунного ответа также влияет тяжесть перенесенного заболевания. Совокупное воздействие описанных факторов усложняет проведение адекватного сравнительного анализа иммунитета после вакцинации и перенесенной инфекции. Результаты посвященных этому исследований весьма противоречивы. Кроме того, в большинстве работ оценка гуморального звена иммунитета против SARS-CoV-2 сводится к измерению уровня антител против S-белка или RBD-последовательности, и характеристике их функциональной активности (вирус-нейтрализующая активность), а исследование В-клеточного иммунитета ограничивается определением количества S- и RBD- специфичных В-клеток памяти. При этом остается упущенной из вида оценка функциональной активности антител, секретируемых плазматическими клетками, полученными от ре-активированных В-клеток памяти в результате повторного столкновения с SARS-CoV-2.

В нашем исследовании https://www.mdpi.com/2073-4409/11/13/1991#cite проводится оценка данной функциональной характеристики. Такая оценка позволяет учесть вклад происходящего с течением времени после инфекции/вакцинации созревания аффинности антител, продуцируемых ре-активированными В-клетками памяти.

Также уникальность нашей работы в том, что сравнение функционального потенциала В-клеток памяти, сформированных в результате вакцинации и вследствие заражения SARS-CoV-2, проводилось с использованием единой аналитической платформы.

Кроме того, используемая в исследовании вакцина – Gam-COVID-Vac– в отличие от большинства существующих на данный момент вакцин содержит в своем составе SARS-CoV-2 S-белок в нативной форме, что позволило провести корректный сравнительный анализ.

Все добровольцы, принявшие участие в исследовании, были разделены на 3 группы:

  • не перенесшие SARS-CoV-2, провакцинированные Спутником (2 дозами) (N/V)
  • ранее инфицированные SARS-CoV-2, провакцинированные Спутником (2 дозами) (PI/V)
  • ранее инфицированные SARS-CoV-2, не получавших вакцинацию (PI/unV).

Промежуток времени между получением первой дозы вакцины/выздоровлением после SARS-CoV-2 и забором образцов крови составил около 6 месяцев.

В задачи нашей работы входило определение и оценка:

  • Концентрации RBD-специфичных антител в сыворотке
  • Концентрации вирус-нейтрализующих антител
  • Количества RBD-специфичных В-клеток памяти, циркулирующих в периферическом кровотоке
  • Количества АСК (антитело-секретирующих клеток), полученных от RBD-специфичных В-клеток памяти
  • Активности антител, полученных от этих клеток, с помощью измерения:

— способности связываться с вирусной последовательностью RBD

— вирус-нейтрализующей способности.

Для реализации поставленных задач применялись 4 основных аналитических подхода:

  • Проточная цитометрия RBD-специфичных клеток
  • ELISpot – анализ количества SARS-CoV-2-специфичных АСК
  • ELISA для количественного определения общего уровня антител, полученных от RBD-специфичных В-клеток памяти
  • Оценка вирус-нейтрализующей способности антител, полученных от RBD-специфичных В-клеток памяти.

В результате проведенных экспериментов были получены следующие результаты:

  • При помощи ELISA определены уровни IgG антител в сыворотке 3 групп через 6 месяцев после инфекции/вакцинации.

Показано, что концентрация IgG анти-RBD в сыворотке в группах, перенесших SARS-CoV-2, была значимо выше, чем в группе вакцинированных добровольцев, не болевших SARS-CoV-2.

  • С использованием псевдотипированного (лентивирусные частицы псевдотипированные диким SARSCoV-2, штаммами дельта и омикрон) коронавируса проведена оценка вирус-нейтрализующей способности данных антител (циркулирующих в плазме).

Вирус-нейтрализующая способность плазмы была существенно выше в группах, перенесших SARS-CoV-2, по сравнению со здоровыми вакцинированными добровольцами. Также наблюдалось сильное ослабление вирус-нейтрализующей способности плазмы во всех трех группах против штаммов дельта- (примерно в 3 раза) и омикрон- (в 10, 8 и 18 раз для групп N/V, PI/V и PI/unV соответственно) по сравнению с таковой для дикого типа.

  • Количественное определение В-клеток памяти проводили при помощи 2 комплементарных методов: проточной цитометрии и ELISpot. Основываясь на способности В-клеток памяти связывать флуоресцентно-меченный RBD, последние определяли с помощью проточной цитометрии (по фенотипу CD19+CD27+IgD-). Для подтверждения полученных результатов проводили ELISpot-анализ антитело-секретирующих клеток, полученных в результате in vitro поликлональной стимуляции (CD40L/IL-21) выделенных В-клеток памяти.

Было показано, что в группах PI/V и PI/unV количество RBD-специфичных В-клеток памяти было примерно в 3 раза выше, чем в группе не перенесших SARS-CoV-2 вакцинированных добровольцев (группа N/V). Что касается антител-секретирующих клеток, полученных после in vitro-стимуляции В-клеток памяти, то они были обнаружены у 60% (9/15), 100% (13/13) и 96% (25/26) добровольцев из групп N/V, PI/V и PI/unV соответственно. Статистически значимые различия были зарегистрированы между группами N/V и PI/V, и PI/V и PI/unV. Однако, необходимо отметить, что через 6 месяцев в образцах крови всех добровольцев количества антител-секретирующих клеток были значительно ниже таковых, взятых от пациентов в ходе острой фазы заболевания или на 85 день после вакцинации (согласно литературным данным).

4)  Антитела, продуцируемые антитело-секретирующими клетками, полученными в результате поликлональной стимуляции CD40L/IL-21 В-клеток памяти, были  оценены с количественной точки зрения (при помощи ELISA измерены уровни IgG, IgA и IgM антител против RBD-последовательности SARSCoV-2 у 3 групп). Функциональные характеристики данных антител оценивались при помощи определения их вирус-нейтрализующей способности в тесте с псевдотипированным вирусом (SARSCoV-2 дикого типа, штаммами дельта и омикрон).

Наибольшее количество добровольцев с высоким уровнем RBD-специфичных IgG составляли группу PI/unV. Самые низкие уровни RBD-специфичных антител класса G были у не болевших SARS-CoV-2 добровольцев (группа N/V). Далее при помощи псевдотипированных S-белком (от SARS-CoV-2 дикого типа, штаммов дельта и омикрон -) лентивирусных частиц был проведен анализ вирус-нейтрализующей способности антител, полученных от стимулированных in vitro В-клеток памяти. Результаты эксперимента показали, что вирус-нейтрализующая способность в супернатантах, полученных от добровольцев группы PI/unV, оказалась приблизительно в 2 раза выше, чем в группе N/V. Интересно, что была выявлена слабая корреляция между концентрациями RBD-специфичных IgG, полученных после in vitro – стимуляции В-клеток памяти, и вирус-нейтрализующей способностью супернатантов.

В отношении исследуемых штаммов SARS-CoV-2 было показано, что супернатанты у всех исследуемых групп проявляли самую высокую нейтрализующую способность против дикого типа вируса и самую низкую – против штамма омикрон.

В целом, проведенное нами исследование позволяет сделать вывод, что в результате перенесенного SARS-CoV-2, иммунитет, опосредованный В-клетками памяти, обеспечивает более длительную и надежную защиту нежели таковой, сформированный благодаря вакцинации. Тем не менее, необходимо иметь ввиду, что вакцинация несет гораздо меньше рисков и имеет более предсказуемые последствия для организма по сравнению с вирусным заболеванием. Наши данные могут быть полезны для оценки необходимости и сроков ревакцинации.